图1 抗原收获时间对ELISA结果的影响
2.2 抗原包被量 当包被的染毒细胞数从1.2×105/孔下降到3.0×104/孔时，阳性血清的OD值只略有下降，但是当抗原包被量从3.0×104/孔下降到3.75×103/孔时，OD值变化较大，从1.5降至0.5(图2)。故本试验将抗原包被量确定为3.0×104/孔。
图2 包被的染毒细胞数对ELISA结果的影响
2.3 固定剂与固定时间 固定的阴性抗原测得的OD值低于未固定的阴性抗原。阳性抗原经固定后，测定的OD值高于未固定的阳性抗原。甲醇和甲醛的固定效果优于乙醇和10%乙醇+4%冰醋酸。本试验将甲醇作为固定剂。在固定时间选择中可看出，固定30 min、1 h、2 h对结果无明显影响(见表1)。本试验将30 min作为固定时间。
2.4 阳性血清的判定标准与OD值界限 利用阳性抗原板测定中和试验阳性血清，20倍稀释时的OD值高于0.3；利用阴性抗原板测定中和试验阳性血清，2～10倍稀释时OD值在0.5～0.2之间，20倍稀释时OD值低于0.2。中和试验阴性血清无论用阳性和阴性抗原板测定，结果均与阳性血清利用阴性抗原板测定的结果相同。据此，以0.2作为OD值的判定界限，20倍稀释的待检血清，若其ELISA检测结果OD值高于0.2，则判定该血清为ELISA抗体阳性血清，否则为阴性血清。
2.5 间接ELISA与中和试验检测结果的比较 分别利用中和试验和间接ELISA测定35份犬血清的CCV抗体效价(图3)，血清效价以OD值高于0.2时的最高稀释倍数表示。5份中和抗体阴性血清的ELISA效价低于1∶20，30份中和抗体阳性血清的间接ELISA测定结果均为阳性。经统计学处理表明，2种方法的测定结果呈正相关(P＜0.05，r＝0.82)。
表1 不同条件下固定抗原对ELISA结果的影响OD值
图3 35份犬血清间接ELISA与中和试验结果比较
3 讨论
本试验建立了检测CCV抗体的间接ELISA方法，经初步应用证实，该方法敏感、特异、快速，可以替代中和试验进行大量的血清样品的检测。该方法以SPA作为酶标记的第2抗体，证实SPA能够与犬IgG特异结合，而HRP-SPA已经是商品化试剂，从而省略了以犬IgG免疫其他动物提纯IgG、HRP标记等繁琐步骤，有利于该方法的推广使用［4］。在操作过程中发现，包被抗原的制备、固定条件以及阳性血清的判定标准对试验结果有很大影响。
3.1 以DK细胞制备包被抗原 本试验所检测的犬主要为军、警犬和宠物犬。这些犬注射过犬用疫苗。而疫苗在生产过程中，不可避免地含有牛血清蛋白及犬细胞、猫细胞中的蛋白质成分。这些成分作为异种抗原能刺激犬体产生相应的抗体。如果利用猫肾传代细胞制备CCV抗原，则犬体内的抗体与细胞成分会发生特异性的抗原-抗体反应，虽然较病毒与相应抗CCV抗体的反应弱，但却成为间接ELISA反应中的非特异性影响因素。单纯地提纯病毒抗原，可以部分地去除细胞成分，但仍不可避免上述反应的发生。选用有病毒增殖的DK细胞作为包被抗原，可以降低非特异性反应的发生。因为犬体对于犬细胞中的蛋白成分可以产生部分免疫耐受，免疫应答反应弱，犬体产生的抗犬细胞蛋白成分的抗体量很低。在实际应用中，适当地提高阳性血清的判定标准，DK细胞与待检样品中的抗犬细胞成分的抗体虽有反应，但不至于影响最终结果的判定。因此，利用本试验方法可以检出免疫犬的抗体水平。
3.2 收毒时间 CCV接种DK细胞后，病毒增殖并释放，引起细胞病变，部分细胞变圆、脱落。据报道，单层接毒后继续培养24～36 h收获的病毒感染力最强［5］。本试验以不同时间收获的细胞作为包被抗原，对标准阳性血清测定的OD值表明，待细胞完全病变后作为包被抗原效果好。虽然收毒时间延长至4 d，早期成熟并释放的病毒感染力下降，但是其并未丧失与CCV抗体发生特异性反应的能力。收毒时间延长，病变细胞数量增多，与特异抗体的反应能力增强，包被酶联反应板时可以减少抗原的使用量，从而降低反应的非特异性。
应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体